特异性融合蛋白免疫组织化学
大多数免疫组化研究针对两个融合伙伴基因其中一个设计的融合蛋白抗体，存在正常组织或者其他肿瘤弱表达或异质性表达的可能，为MDP了解决这一缺陷，已经研发了针对跨越参与融合的两个蛋白质序列的新型抗体。
（1）滑膜肉瘤
滑膜肉瘤（SS）的特征是病理性t（X；18）（p11；q11）易位，导致SS18-SSX基因重排。最近开发的针对SS18-SSX基因融合的特异性单克隆抗体已经被证明对SS的诊断具有87-95%的敏感性和完美的特异性。有趣的是，针对SSX C末端的抗体敏感性略高（92-100%），特异性虽然不绝对完美，也非常高（93-96%）。因此研究作者提出免疫组化的方法在大多数情况下可以取代分子细胞遗传学检测。
（2）腺泡状横纹肌肉瘤
重现性PAX3-FOXO1或较不常见的PAX7-FOXO1基因重排是腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）遗传学改变。Azorsa等人最近开发了针对PAX3-FOXO1融合癌蛋白连接区的单克隆抗体。通过免疫组化对横纹肌肉瘤样本中PAX3-FOXO1或PAX7-FOXO1的检测表现出100%的特异性和91%的敏感性。与PAX3-FOXO1表达的肿瘤相比，PAX7-FOXO1表达的肿瘤显示出异质性染色，有“分散的阳性细胞”，表明这种免疫组化方法不仅可以帮助识别基因融合阳性肿瘤，而且还可以提示融合基因是PAX3还是PAX7。
易位相关基因表达特征
除了直接评估重现性改变的蛋白质外，免疫组化还能够分析这些蛋白质下游发生的基因表达变化。这种诊断方法利用了这样一个事实，即肉瘤中的复发性致癌驱动基因突变通常会介导广泛的、往往是独特的基因表达程序。了解肉瘤中重现性遗传异常介导的基因表达变化导致从而在在免疫组化上的不同表现，有助于识别这些变化可能是一个重要的诊断陷阱。
（1）CIC重排圆细胞肉瘤
CIC重排肉瘤表现出独特的转录特征，包括几个可被免疫组化靶向的过表达基因。在这些上调基因中，ETV4和WT1是研究较多的两个抗体（图6）。虽然这两种标记物对CIC重排肉瘤的诊断都非常敏感（>90%），特别ETV4在弥漫性表达的情况下，更具特异性。ETV4和其他ETS转录因子ETV1和ETV5的表达可以通过RNA原位杂交作为免疫组化的替代物进行诊断评估。尽管促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤（DSRCT）中WT1的过表达反映了其C端在EWSR1-WT1融合蛋白中的结合，但CIC重排肉瘤中WT1表达代表了该基因位点的转录激活。因此，针对WT1的N端或C端的抗体在CIC重排的圆细胞肉瘤中表现出弥漫性胞核阳性，而只有针对C端的抗体表达于DSRCT。
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图6MDP：CIC-DUX4重排肉瘤HE染色（A）、N端WT1免疫组化（B）和C端WT1免疫组化（C）
（2）尤文肉瘤
在初步研究确定NKX2.2是由EWSR1-FLI1驱动的致癌基因表达程序的关键媒介后，学者们发现免疫组化检测转录因子NKX2.2在很大程度上可以将尤文肉瘤与其类似肿瘤区分开来。NKX2.2是高度敏感的，表达于所有EWSR1/FUS与ETS结构域蛋白（例如FLI1、ERG）融合的Ewing肉瘤和EWSR1-NFATC2融合肉瘤中。需要注意的是，除了在间叶性软骨肉瘤可表达外、NKX2.2可在小部分的滑膜肉瘤、小细胞癌、恶性黑色素瘤、DSRCT、神经母细胞瘤、肌上皮瘤和大多数嗅觉神经母细胞瘤中表达。
与NKX2-2类似，PAX7是尤文氏肉瘤融合癌蛋白的转录靶点，在99%以上的尤文肉瘤中观察到PAX7表达，具有典型的强和弥漫性染色模式（图7）。PAX7作为哺乳动物骨骼肌生成的一种转录因子，在大多数横纹肌肉瘤和其他具有横纹肌肉瘤分化的肿瘤（如恶性蝾螈瘤）以及部分滑膜肉瘤和BCOR-CCNB3基因重排肉瘤中表达。与NKX2-2非常相似，PAX7也在EWSR1-NFATC2基因易位相关肉瘤中稳定表达。
图7：Ewing肉瘤HE染色（A）和PAX7免疫组化（B）
（3）滑膜肉瘤
多项研究发现，TLE1（transducin-like enhancer 1）是滑膜肉瘤中的一种高表达基因，它编码一种位于细胞核并抑制细胞分化的转录辅抑制物（transcriptional corepressor）。免疫组化检测TLE1在滑膜肉瘤中表达的敏感性为94%。滑膜肉瘤中TLE1染色通常是弥漫强阳性（50%以上的肿瘤细胞染色）。TLE1也可在孤立性纤维性肿瘤、横纹肌肉瘤、子宫内膜间质肉瘤和周围神经鞘瘤等中表达。此外，大多数BCOR-CCNB3和CIC重排肉瘤表达TLE1。通常，TLE1染色在滑膜肉瘤以外的肿瘤中较弱表达。总体而言，meta分析估计TLE1诊断滑膜肉瘤的特异性为81%。
（4）腺泡状横纹肌肉瘤（腺泡状RMS）
腺泡状RMS与其他亚型RMS在预后和治疗方面有差异，因此需要鉴别出来。微阵列研究发现P-cadherin和AP2β可作为腺泡状RMS重现性融合癌蛋白的候选标记物。当联合使用时，P-cadherin和AP2β诊断腺泡状RMS的特异性为98%，但敏感性仅为64%。结合myogenin、腺泡状RMS标志物NOS1、AP2β以及胚胎RMS标志物HMGA2对腺泡状RMS的诊断具有96%的敏感性和91%的特异性。
（5）间叶性软骨肉瘤
在形态学特征不明确的病例中诊断间叶性软骨肉瘤可能需要对HEY1-NCOA2基因易位进行分子细胞遗传学确认。NKX3-1是前列腺腺癌标志物，在大多数间叶性软骨肉瘤中广泛表达（图8）。在NKX3-1表达的软组织肿瘤的鉴别诊断中，必须考虑间叶性软骨肉瘤和EWSR1-NFATC2重排的肉瘤，这是NKX3-1的潜在陷阱。
图8：间叶性软骨肉瘤HE染色（A）和NKX3-1免疫组化（B）
（6）低度恶性纤维黏液样肉瘤/硬化性上皮样纤维肉瘤（LGFMS/SEF）
低度恶性纤维黏液样肉瘤（LGFMS）与重现性FUS-CREB3L2/FUS-CREB3L1基因融合相关，其介导了一种独特的基因表达谱，其中包括MUC4等基因过表达。MUC4是LGFMS的高度敏感标记物，在绝大多数病例中表达在细胞质。MUC4 在LGFMS的鉴别诊断中也非常特异。重现性FUS-CREB3L2/FUS-CREB3L1融合还可出现在硬化性上皮样纤维肉瘤（SEF）中，大约78%的SEF细胞质表达MUC4（图9）。MUC4阴性SEF可能部分携带涉及YAP1和KMT2A的基因融合。
图9：硬化性上皮样纤维肉瘤HE染色（A）和MUC4免疫组化（B）
结论和未来展望
重现性遗传异常的免疫组化检测代表了组织学和分子病理学关联的一个关键诊断工具，提高了肿瘤分类的效率和可行性。随着诊断应用数量的增加和范围越广，免疫组化替代分子遗传学异常的使用肯定会发展起来。抗体标记物多重显微成像技术的进步提供了新的方法来有效的评估更大组别分子替代标记物。有了这些技术，我们可以设想在一个组织学切片上分析几十个抗体标记物作为分子遗传学异常的替代标记物。
参考：
Black MA, Charville GW. Diagnosis of soft tissue tumors using immunohistochemistry as a surrogate for recurrent fusion oncoproteins. Semin Diagn Pathol. 2022;39(1):38-47. doi:10.1053/j.semdp.2021.10.005
编译-黄慧 主治医师 江西省儿童医院病理科
审校-欧阳斌燊 主治医师 上海交通大学医学院附属瑞金医院病理科
本文系NGDP新病理团队编译，转载请联系授权
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